O teste de endotoxinas bacterianas: um guia prático
Se você está envolvido no desenvolvimento, fabricação ou controle de qualidade de produtos farmacêuticos ou dispositivos médicos que entram em contato com sangue humano ou líquido cefalorraquidiano, você precisa saber sobre o teste de endotoxinas bacterianas (BET). Este teste é essencial para garantir a segurança e eficácia dos seus produtos, bem como o cumprimento dos requisitos regulamentares. Neste artigo, explicaremos o que são as endotoxinas bacterianas, por que são importantes, como realizar o BET, quais são os diferentes métodos disponíveis, como compará-los e como evitar armadilhas comuns. Ao final deste artigo, você terá um guia prático para conduzir o BET em seu laboratório ou instalação.
O que são endotoxinas bacterianas e por que são importantes?
As endotoxinas bacterianas são substâncias tóxicas que são liberadas da parede celular de bactérias gram-negativas quando elas morrem ou se multiplicam. Eles são compostos de lipopolissacarídeos (LPS), que são moléculas complexas que consistem em uma porção lipídica (a endotoxina) e uma porção polissacarídica (o antígeno). As endotoxinas bacterianas podem causar febre, inflamação, choque, falência de órgãos e morte em humanos e animais se entrarem na corrente sanguínea ou em outros fluidos corporais estéreis. Eles também são conhecidos como pirogênios, que significa "produtores de febre".
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As endotoxinas bacterianas podem contaminar produtos farmacêuticos ou dispositivos médicos destinados a uso parenteral (injeção), intratecal (espinal) ou oftálmico (olho). Eles também podem estar presentes em sistemas de água ou matérias-primas que são usadas para fabricar ou processar esses produtos ou dispositivos. Portanto, é fundamental testar as endotoxinas bacterianas antes de lançar qualquer produto ou dispositivo no mercado, bem como monitorar seus níveis durante a produção e armazenamento. Isso não é apenas uma questão de garantia de qualidade, mas também uma obrigação legal.De acordo com várias farmacopeias (como USP, EP, JP) e agências reguladoras (como FDA, EMA), qualquer produto ou dispositivo destinado a uso parenteral, intratecal ou oftálmico deve atender a determinadas especificações para endotoxinas bacterianas. Essas especificações variam dependendo do tipo, via e dose do produto ou dispositivo, mas geralmente são expressas como um limite máximo permitido de endotoxina (MEL) em unidades de endotoxina por mililitro (EU/mL) ou quilograma (EU/kg).
O que é o teste de endotoxinas bacterianas (BET) e como funciona?
O teste de endotoxinas bacterianas (BET) é um teste in vitro que detecta e quantifica as endotoxinas bacterianas em uma amostra. O teste é baseado na reação entre endotoxinas bacterianas e um reagente biológico chamado Limulus Lisado de amebócitos Limulus (LAL). LAL é uma solução que contém as células sanguíneas (amebócitos) de um caranguejo-ferradura (Limulus polyphemus) que foram lisadas (quebradas) para liberar seu conteúdo. Esses conteúdos incluem enzimas e proteínas que são sensíveis a endotoxinas bacterianas e podem desencadear uma cascata de reações que resultam em uma mudança mensurável. Dependendo do método utilizado, essa alteração pode ser a formação de um coágulo de gel, uma alteração na turbidez (nebulosidade) ou uma alteração na cor. Comparando a resposta da amostra com a de uma curva padrão de concentrações de endotoxinas conhecidas, a quantidade de endotoxinas na amostra pode ser calculada.
Quais são os diferentes métodos de BET e como escolher o melhor?
Existem três métodos principais de BET amplamente utilizados e aceitos por farmacopeias e agências reguladoras. Eles são o método do gel clot, o método turbidimétrico e o método cromogênico. Cada método tem suas próprias vantagens e desvantagens, e a escolha do melhor depende de vários fatores, como tipo e natureza da amostra, sensibilidade e acurácia requeridas, equipamentos e recursos disponíveis, preferência e experiência do usuário.Aqui está uma breve visão geral de cada método e como eles diferem um do outro.
O Método de Coágulo de Gel
O princípio e o procedimento do método de gel clot
O método de gel clot é o método mais simples e antigo de BET. Baseia-se na capacidade das endotoxinas bacterianas de ativar a cascata de coagulação no LAL, resultando na formação de um gel firme que permanece intacto quando invertido. O método do gel clot pode ser realizado de duas formas: qualitativa ou semiquantitativa. O método qualitativo também é conhecido como teste de limite ou teste passa/falha. Envolve o teste de uma amostra em uma única diluição contra um reagente LAL de controle que contém uma quantidade predeterminada de endotoxina (geralmente igual ou menor que o MEL). Se um gel se formar em ambos os tubos, a amostra passa no teste. Se um gel se formar apenas no tubo de controle, a amostra falha no teste. Se nenhum gel se formar em nenhum dos tubos, o teste é inválido e deve ser repetido. O método semiquantitativo também é conhecido como teste de ponto final ou teste de titulação. Envolve o teste de uma série de diluições da amostra contra um reagente LAL de controle que contém uma quantidade conhecida de endotoxina (geralmente igual ou maior que o MEL). O ponto final é determinado encontrando a diluição mais alta da amostra que ainda forma um gel com o reagente LAL de controle. A concentração de endotoxina na amostra pode então ser calculada multiplicando a diluição do ponto final pela concentração de endotoxina de controle.
As vantagens e desvantagens do método de gel clot
O método de gel clot apresenta algumas vantagens em relação a outros métodos de BET, tais como:
É simples, fácil e barato de executar.
Não requer nenhum equipamento ou instrumento especial.
É robusto e confiável para a maioria dos tipos de amostras.
É menos suscetível à interferência de substâncias que podem afetar outros métodos.
No entanto, o método de gel clot também apresenta algumas desvantagens, como:
É subjetivo e depende da observação visual.
Tem baixa sensibilidade e precisão em comparação com outros métodos.
Possui faixa dinâmica limitada e requer múltiplas diluições para amostras com níveis de endotoxina altos ou baixos.
Tem longo tempo de incubação e baixo rendimento.
A validação e interpretação do método de gel clot
O método de gel clot requer validação antes do uso para garantir sua adequação para uma amostra e aplicação específica. O processo de validação envolve a realização de vários testes para verificar parâmetros como sensibilidade, especificidade, linearidade, precisão, exatidão, robustez e recuperação. O processo de validação também envolve a determinação do fator de diluição ideal para cada amostra para evitar resultados falsos positivos ou negativos devido a fatores como interferência, aumento ou inibição. O processo de validação deve seguir as orientações e recomendações das farmacopéias e agências reguladoras.
A interpretação dos resultados do método de gel clot depende se é realizada qualitativamente ou semi-quantitativamente. Para resultados qualitativos, uma decisão de aprovação/reprovação é tomada com base na formação do gel em ambos os tubos ou apenas em um tubo. Para resultados semiquantitativos, uma concentração de endotoxina é calculada com base na diluição do ponto final e na concentração de endotoxina de controle. A concentração de endotoxina calculada deve ser comparada com a MEL para determinar se a amostra atende à especificação ou não. A interpretação dos resultados também deve levar em consideração quaisquer fatores que possam afetar a validade ou confiabilidade do teste, como interferência, aumento, inibição ou contaminação. A interpretação dos resultados deve seguir as orientações e recomendações das farmacopéias e agências reguladoras.
O Método Turbidimétrico
O princípio e procedimento do método turbidimétrico
O método turbidimétrico é um método mais avançado e sensível de BET.Baseia-se na capacidade das endotoxinas bacterianas de ativar a cascata de coagulação no LAL, resultando na formação de um precipitado que aumenta a turbidez (nebulosidade) da solução. O método turbidimétrico pode ser realizado de duas formas: cinética ou ponto final. O método cinético também é conhecido como método cinético-turbidimétrico (KTM) ou método cinético-quantitativo (KQCL). Envolve medir a mudança na turbidez ao longo do tempo usando um espectrofotômetro ou um nefelômetro. A taxa e a extensão do aumento da turbidez são proporcionais à quantidade de endotoxinas na amostra. O método cinético pode ser usado para determinar a concentração de endotoxina na amostra comparando a curva de reação com uma curva padrão de concentrações de endotoxina conhecidas. O método de ponto final também é conhecido como método turbidimétrico de coagulação em gel (GCTM) ou método quantitativo de coagulação em gel (GQCL). Envolve a medição da turbidez final após um tempo de incubação fixo usando um espectrofotômetro ou um nefelômetro. A turbidez final é proporcional à quantidade de endotoxinas na amostra. O método de ponto final pode ser usado para determinar a concentração de endotoxina na amostra comparando a turbidez final com uma curva padrão de concentrações de endotoxina conhecidas.
As vantagens e desvantagens do método turbidimétrico
O método turbidimétrico apresenta algumas vantagens em relação a outros métodos de BET, tais como:
É mais sensível e preciso do que o método de coágulo de gel.
Possui uma faixa dinâmica mais ampla e requer menos diluições para amostras com níveis de endotoxina altos ou baixos.
Tem menor tempo de incubação e maior rendimento do que o método de gel coagulado.
É objetivo e independente da observação visual.
No entanto, o método turbidimétrico também apresenta algumas desvantagens, tais como:
Requer equipamentos e instrumentos especiais que são mais caros e complexos do que os utilizados para o método de gel clot.
É mais suscetível à interferência de substâncias que podem afetar a medição da turbidez, como proteínas, lipídios, sais ou corantes.
Requer mais validação e calibração do que o método de gel clot.
A validação e interpretação do método turbidimétrico
O método turbidimétrico requer validação antes do uso para garantir sua adequação a uma amostra e aplicação específicas. O processo de validação envolve a realização de vários testes para verificar parâmetros como sensibilidade, especificidade, linearidade, precisão, exatidão, robustez e recuperação. O processo de validação também envolve a determinação do fator de diluição ideal para cada amostra para evitar resultados falsos positivos ou negativos devido a fatores como interferência, aumento ou inibição. O processo de validação deve seguir as orientações e recomendações das farmacopéias e agências reguladoras.
A interpretação dos resultados do método turbidimétrico depende se ele é realizado cineticamente ou no ponto final. Para resultados cinéticos, uma concentração de endotoxina é calculada com base na curva de reação e na curva padrão de concentrações de endotoxina conhecidas. A concentração de endotoxina calculada deve ser comparada com a MEL para determinar se a amostra atende à especificação ou não. Para resultados finais, uma concentração de endotoxina é calculada com base na turbidez final e na curva padrão de concentrações de endotoxina conhecidas. A concentração de endotoxina calculada deve ser comparada com a MEL para determinar se a amostra atende à especificação ou não. A interpretação dos resultados também deve levar em consideração quaisquer fatores que possam afetar a validade ou confiabilidade do teste, como interferência, aumento, inibição ou contaminação. A interpretação dos resultados deve seguir as orientações e recomendações das farmacopéias e agências reguladoras.
O Método Cromogênico
O princípio e procedimento do método cromogênico
O método cromogênico é outro método avançado e sensível de BET. Baseia-se na capacidade das endotoxinas bacterianas de ativar a cascata de coagulação no LAL, resultando na clivagem de um substrato peptídico sintético que libera um cromóforo (agente corante) que pode ser medido espectrofotometricamente. O método cromogênico pode ser realizado de duas formas: cinética ou ponto final. O método cinético também é conhecido como método cinético-cromogênico (KCM) ou método cinético-colorimétrico (KCCL). Envolve medir a mudança de cor ao longo do tempo usando um espectrofotômetro. A taxa e a extensão do aumento da cor são proporcionais à quantidade de endotoxinas na amostra. O método cinético pode ser usado para determinar a concentração de endotoxina na amostra comparando a curva de reação com uma curva padrão de concentrações de endotoxina conhecidas. O método de ponto final também é conhecido como método cromogênico de coagulação em gel (GCCM) ou método colorimétrico de coagulação em gel (GCCL). Envolve a medição da cor final após um tempo de incubação fixo usando um espectrofotômetro. A cor final é proporcional à quantidade de endotoxinas na amostra. O método de ponto final pode ser usado para determinar a concentração de endotoxina na amostra comparando a cor final com uma curva padrão de concentrações de endotoxina conhecidas.
As vantagens e desvantagens do método cromogênico
O método cromogênico apresenta algumas vantagens sobre outros métodos de BET, como:
É mais sensível e preciso do que o método de coágulo de gel.
Possui uma faixa dinâmica mais ampla e requer menos diluições para amostras com níveis de endotoxina altos ou baixos.
Tem menor tempo de incubação e maior rendimento do que o método de gel coagulado.
É objetivo e independente da observação visual.
É mais específico e seletivo para endotoxinas bacterianas do que outros métodos.
No entanto, o método cromogênico também apresenta algumas desvantagens, como:
Requer equipamentos e instrumentos especiais que são mais caros e complexos do que os utilizados para o método de gel clot.
É mais suscetível à interferência de substâncias que podem afetar a medição da cor, como proteínas, lipídios, sais ou corantes.
Requer mais validação e calibração do que o método de gel clot.
A validação e interpretação do método cromogênico
O método cromogênico requer validação antes do uso para garantir sua adequação a uma amostra e aplicação específicas. O processo de validação envolve a realização de vários testes para verificar parâmetros como sensibilidade, especificidade, linearidade, precisão, exatidão, robustez e recuperação. O processo de validação também envolve a determinação do fator de diluição ideal para cada amostra para evitar resultados falsos positivos ou negativos devido a fatores como interferência, aumento ou inibição. O processo de validação deve seguir as orientações e recomendações das farmacopéias e agências reguladoras.
A interpretação dos resultados do método cromogênico depende se ele é realizado cineticamente ou no ponto final. Para resultados cinéticos, uma concentração de endotoxina é calculada com base na curva de reação e na curva padrão de concentrações de endotoxina conhecidas. A concentração de endotoxina calculada deve ser comparada com a MEL para determinar se a amostra atende à especificação ou não. Para resultados finais, uma concentração de endotoxina é calculada com base na cor final e na curva padrão de concentrações de endotoxina conhecidas. A concentração de endotoxina calculada deve ser comparada com a MEL para determinar se a amostra atende à especificação ou não. A interpretação dos resultados também deve levar em consideração quaisquer fatores que possam afetar a validade ou confiabilidade do teste, como interferência, aumento, inibição ou contaminação.A interpretação dos resultados deve seguir as orientações e recomendações das farmacopéias e agências reguladoras.
Comparação dos Métodos BET
Para ajudá-lo a escolher o melhor método de BET para sua amostra e aplicação, aqui está uma tabela que resume as principais características, vantagens e desvantagens de cada método.
Método Princípio Sensibilidade Precisão Alcance Dinâmico Tempo de Incubação Rendimento Equipamento Interferência Validação --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- Coágulo de Gel Formação de um gel que permanece intacto quando invertido Baixo Baixo Limitada Longo Baixo Nenhum Baixo Baixo Turbidimétrico Aumento da turvação (nebulosidade) medido espectrofotometricamente ou nefelometricamente alta alta Largo Curto alta Espectrofotômetro ou nefelômetro alta alta Cromogênico Libertação de um cromóforo (agente corante) medida espectrofotometricamente alta alta Largo Curto alta Espectrofotômetro alta alta Dicas e truques para BET
Aqui estão algumas dicas e truques para executar BET com sucesso e evitar fontes comuns de erro e contaminação.
Como preparar amostras e reagentes para BET
Use vidraria, pipetas, tubos e outros materiais estéreis e apirogênicos para o BET.
Use água para BET (WFB) ou água para injeção (WFI) como diluente e solvente para amostras e reagentes.
Use material de vidro ou plástico despirogenado para aquecer amostras ou reagentes que requerem tratamento térmico.
Use o grau de reagente LAL (LRG) apropriado para seu método e tipo de amostra. Os LRGs são classificados em quatro graus: A, B, C e D, dependendo de sua sensibilidade e especificidade.
Use endotoxina padrão de controle (CSE) apropriada para seu método e reagente LAL. Os CSEs são derivados da cepa de Escherichia coli O113:H10:K negativa e têm uma potência de 10 EU/ng.
Armazene amostras e reagentes de acordo com seus rótulos e instruções. Evite a exposição à luz, calor, umidade ou contaminação.
Misture as amostras e os reagentes delicadamente, mas completamente, antes de usar. Evite agitar, vórtex ou espumar.
Use amostras e reagentes frescos sempre que possível. Não use amostras ou reagentes vencidos ou deteriorados.
Como evitar fontes comuns de erro e contaminação no BET
Realize BET em um ambiente limpo e controlado. Use capelas de fluxo laminar, cabines de biossegurança ou salas limpas, se disponíveis.
Use equipamento de proteção individual (EPI) adequado, como luvas, máscaras, aventais e toucas. Troque os EPIs com frequência e descarte-os adequadamente.
Use controles positivos e negativos para monitorar o desempenho do teste. Os controles positivos contêm quantidades conhecidas de endotoxinas para verificar a sensibilidade e precisão do teste. Os controles negativos não contêm endotoxinas para verificar a ausência de contaminação ou interferência no teste.
Use espaços em branco para corrigir qualquer turbidez ou cor de fundo nas amostras ou reagentes. Os brancos contêm apenas diluente ou solvente sem qualquer amostra ou reagente.
Realize testes duplicados ou triplicados para garantir a reprodutibilidade e precisão do teste. Calcule a média e o desvio padrão dos resultados e compare-os com os critérios de aceitação.
Realize testes de recuperação de pico para garantir a precisão e a recuperação do teste. Os testes de recuperação de pico envolvem a adição de quantidades conhecidas de endotoxinas às amostras antes de testá-las e comparar os resultados com os obtidos de amostras não adicionadas.
Realize testes de interferência para garantir a especificidade e seletividade do teste. Os testes de interferência envolvem o teste de amostras que contêm substâncias que podem afetar o teste, como proteínas, lipídios, sais ou corantes, e a comparação dos resultados com os obtidos de amostras sem essas substâncias.
Como cumprir os requisitos e padrões regulatórios para BET
Siga as orientações e recomendações das farmacopeias e agências reguladoras para a realização do BET.Algumas das fontes mais comuns e relevantes são: USP , EP 2.6.14, JP 4.01, FDA Guidance for Industry: Pyrogen and Endotoxins Testing e EMA Guideline on Validation of the Limulus Amebocyte Lysate Test as an End-Product Endotoxin Test for Human and Animal Parenteral Drugs, Biological Products, and Medical Devices.
Use materiais de referência certificados (CRMs) e padrões rastreáveis para BET. CRMs são materiais que foram caracterizados e certificados por uma autoridade reconhecida por seu conteúdo e potência de endotoxina. Padrões rastreáveis são padrões que podem ser rastreados até um CRM ou um padrão primário por meio de uma cadeia ininterrupta de comparações.
Documente e registre todas as etapas e resultados do BET. Use procedimentos operacionais padrão (SOPs), protocolos de teste, relatórios de teste e planilhas de dados para garantir a consistência, transparência e rastreabilidade da BET.
Realize auditorias e inspeções regulares da BET. Use auditorias e inspeções internas e externas para verificar a conformidade, qualidade e desempenho da BET.
Conclusão
O teste de endotoxinas bacterianas (BET) é um teste vital para garantir a segurança e eficácia de produtos farmacêuticos e dispositivos médicos que entram em contato com sangue humano ou líquido cefalorraquidiano. É também uma obrigação legal cumprir os requisitos e normas regulamentares da BET. Existem três métodos principais de BET: o método do gel clot, o método turbidimétrico e o método cromogênico. Cada método tem suas próprias vantagens e desvantagens, e a escolha do melhor depende de vários fatores. O método do gel clot é simples, fácil, barato, robusto e confiável, mas é subjetivo, de baixa sensibilidade, baixa precisão, faixa dinâmica limitada, longo tempo de incubação e baixo rendimento.O método turbidimétrico é mais sensível, preciso, ampla faixa dinâmica, tempo de incubação curto, alto rendimento, objetivo do que o método gel clot, mas requer equipamentos especiais, instrumentos mais caros e complexos do que os usados para o método gel clot. Também é mais suscetível à interferência de substâncias que podem afetar a medição da turbidez. O método cromogênico é mais sensível, preciso, ampla faixa dinâmica, tempo de incubação curto, alto rendimento, objetivo e mais específico e seletivo para endotoxinas bacterianas do que o método gel clot, mas também requer equipamentos e instrumentos especiais, mais caros e complexos do que os usados para o método gel clot. Também é mais suscetível à interferência de substâncias que podem afetar a medição da cor. Para realizar o BET com sucesso e evitar fontes comuns de erro e contaminação, é importante seguir algumas dicas e truques, como preparar amostras e reagentes adequadamente, usar controles positivos e negativos, realizar testes duplicados ou triplicados, realizar testes de recuperação de picos, realizar testes de interferência, cumprir requisitos e normas regulamentares, usar materiais de referência certificados e padrões rastreáveis, documentar e registrar todas as etapas e resultados do BET e realizar auditorias e inspeções regulares do BET. Seguindo este guia prático, você será capaz de conduzir BET em seu laboratório ou instalação com confiança e competência.
perguntas frequentes
Aqui estão algumas perguntas e respostas frequentes sobre a BET.
Qual é a diferença entre pirogênios e endotoxinas?
Pirogênios são substâncias que podem causar febre em humanos ou animais quando injetadas ou implantadas. As endotoxinas são um tipo de pirogênio derivado da parede celular de bactérias gram-negativas. Nem todos os pirogênios são endotoxinas, mas todas as endotoxinas são pirogênios.
Qual é a unidade da endotoxina?
A unidade de endotoxina é a unidade de endotoxina (EU).Um EU é equivalente a 0,1 nanogramas de uma endotoxina de referência derivada da cepa de Escherichia coli O113:H10:K negativa.
Qual é a diferença entre LAL e LRG?
LAL é lisado de amebócitos limulus, que é uma solução que contém as células sanguíneas (amebócitos) de um caranguejo-ferradura (Limulus polyphemus) que foram lisadas (quebradas) para liberar seu conteúdo. LRG é grau de reagente LAL, que é uma classificação de LAL com base em sua sensibilidade e especificidade para endotoxinas bacterianas. Existem quatro graus de LRG: A, B, C e D.
Qual é a diferença entre CSE e CRM?
CSE é a endotoxina padrão de controle, que é uma solução que contém uma quantidade conhecida de endotoxina derivada da cepa de Escherichia coli O113:H10:K negativa. O CRM é um material de referência certificado, que é um material que foi caracterizado e certificado por uma autoridade reconhecida por seu conteúdo e potência de endotoxina.
Quais são alguns exemplos de produtos ou dispositivos que requerem BET?
Alguns exemplos de produtos ou dispositivos que requerem BET são: drogas injetáveis, vacinas, produtos biológicos, hemoderivados, soluções de diálise, soluções de infusão, soluções de irrigação, colírios, soluções para lentes de contato, dispositivos implantáveis, cateteres, seringas, agulhas, instrumentos cirúrgicos, etc. 0517a86e26
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